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不要碰触管壁的树脂。加入裂解液从磁力架上去下管子 短暂涡旋振

鏃ユ湡;2019-06-18  鏉ユ簮锛毼粗  浣滆咃細admin

  不要碰触管壁的树脂。加入裂解液从磁力架上去下管子 短暂涡旋振荡 使磁珠悬浮 将管子放回磁力架上并去掉所有裂解液。加入制备的洗涤液 从磁力架上取下管子短暂涡旋振荡 然后将管子放回磁力架上 并去掉所有洗 涤液。洗涤液洗涤重复次 并保证最后一次去除所有溶液 。将磁力架上的管 子打开盖子 空气中干燥。加入洗

  不要碰触管壁的树脂。加入裂解液从磁力架上去下管子 短暂涡旋振荡 使磁珠悬浮 将管子放回磁力架上并去掉所有裂解液。加入制备的洗涤液 从磁力架上取下管子短暂涡旋振荡 然后将管子放回磁力架上 并去掉所有洗 涤液。洗涤液洗涤重复次 并保证最后一次去除所有溶液 。将磁力架上的管 子打开盖子 空气中干燥。加入洗脱液 盖上盖子 短暂涡旋振荡使 树脂悬浮 水浴加热。从水浴池中取出管子后短暂涡旋振荡立即 放到磁力架上。小心将溶液转移到指定管内 备用或储存。 复合扩增 采用扩增试剂盒 美国 型扩增仪进行 扩增。扩增试剂盒扩增体系为 模板 扩增循环参数为 个循环保温。 遗传分析仪电泳检测 扩增试剂盒 向孔电泳板的每个样品孔内 加入 甲酰胺 内标 扩增产物或者标准等位基因阶梯。 将样品板水平离心放入型遗传分析仪电泳 软件分析。 定量 采用荧光定量试剂盒 使用型实时荧光定 量仪进行定量。用溶液两倍稀释标准品溶液 制备出浓度 分别为 的个不同浓度的标准品。反应体系为采用孔 光学板 每孔加入 模板、 标准品或者对照品。光学板加样完成后 盖上光学膜 水平离心后放入定 量仪中 启动 软件 编写样本 。扩增条件为 表并在图表中对应选定检测指标选择 个循环。点击“”开始扩增。进 入页面 点击进行数据分析并查看结果。 统计学处理 统计分析使用 统计软件进行 方法比较采用析因设计资料的 方差分析 而组间两两比较选用方法 计数资料选用卡方检验方法 为统计检验水准。、结果 三种提取方法的比较 三种不同提取方法得到的含量差异有统计学意义 纯化法提取 其中 提取结合 平均量显著高于磁珠提取、 提取结合磁珠纯化法 提取法与提取结合磁珠纯化法提取平均含量无统计学差异。且 三种提取方法与脱蜡方法间交互效应无统计学意义 。如表 三种脱蜡方法的比较 三种不同脱蜡方法得到的含量有统计学差异 其中 采用二甲苯脱蜡方法均优于另外两种方法 两两比较值均为小于 水浴 加热脱蜡方法同样优于微波脱蜡的方法 。如表 第一章福尔马林固定石蜡包埋组织中种提取方法的比较研究 表三种方法提取的量的比较 ‘主效应的统计量和值 ”交互效应的统计量和值。提取方法间两两比较 层析柱纯化 磁珠提取层析柱纯化 磁珠纯化 二甲苯微波水浴微波 珠纯化 。脱蜡间两两比较二甲苯水浴 分型结果在本实验中 按所检样本个及个以上基因座成功分型 且基因 座等位基因峰高相对荧光单位计成功率。采用二甲苯脱蜡情况下 三种提取方法分型成功率分别为 而三种方法提取率差异无统计学意义 。如表 表三种提取方法分型结果的比较硕士学位论文 分型成功 分型未成功 图三种提取方法分型结果比较的柱状图 、讨论 长期以来福尔马林一直作为临床检查和科学研究中常用的固定液。因为其对 组织的渗透能力、保存组织及细胞结构的完整性、保留组织内抗原的可测性均 优于其他固定液 而得到广泛的认可。但是 随福尔马林固定液作用时间的延 可导致生物大分子之间形成广泛的亚甲基交联桥使分子的脆性增加 在遭受剪切力作用的时候 更容易发生断裂 同时 可使或与蛋白 质之间形成广泛的交联 生成牢固的复合物 阻碍了蛋白酶对组织的消化 响了对固定组织中的提取。此外 如果使用非缓冲型的福尔马林固定 由于暴露于空气中的甲醛可被氧化生成甲酸增加了固定液的酸性 降低 环境的值 这些因素都将导致发生降解【 。在石蜡包埋过程中 组织 浸蜡与包埋需加热 易使部分双链发生解链 组织残留的甲醛便可对 单链进行甲基化修饰 导致单链在冷却后不能复性 而更易发生降解。另 石蜡可以阻碍蛋白酶与组织接触从而影响组织消化及的释放。 在对石蜡包埋组织提取的过程中 一个重要的环节就是脱蜡。能否成 功脱蜡 能否彻底脱蜡将直接影响提取和扩增的效果【 。同时 还必须确保脱第一章福尔马林固定石蜡包埋组织中种提取方法的比较研究 蜡过程中不额外增加外源性的抑制因子 并尽量减少产生对的额外 损伤。基于上述条件 本次研究采用了三种脱蜡方法进行比较 分别为 二甲 苯脱蜡、水浴加热脱蜡和微波加热脱蜡。二甲苯是常被用于石蜡包埋组织脱蜡 的高效有机溶剂。其可在室温下浸泡石蜡包埋组织 使石蜡溶解于二甲苯之中 然后使用无水乙醇同时除去二甲苯以及残留的甲醛 从而达到彻底脱蜡的目的 。水浴 并且更有利于组织的消化 所以目前仍作为一种常规的脱蜡方式在使用【 脱蜡的优点在于向组织加入了溶液 其中的和起到了保护 则可以起到脱脂脱蜡的作用【 同时水浴加热至接近石蜡熔点的温度 。熔蜡 从而达到有效脱蜡的目的 而微波脱蜡同样加入了包含和 的消化缓冲液保护 更利用电磁波的穿透力 迅速对组织深层进行加热 从而起到脱蜡的作用。虽然在既往的研究中 有人提出微波加热脱蜡的效 果值得肯定 而且具有操作简单 实验消耗少 污染危险性小等优点 但在本 次实验中 并未能得到与此相同的结论 经二甲苯脱蜡处理后的组织提取出的 含量明显高于另外两种加热脱蜡方法 而水浴加热脱蜡的效果又明显好于 微波加热脱蜡的效果。原因可能为加热脱蜡可导致不稳定 而且组织在受 热过程中可释放出一些金属离子及核酸酶等导致损伤的发生 加热的时间 越长温度越高 受损的程度越严重 这也解释了为何水浴加热的效果好 于微波加热。 是一种由聚乙烯、乙二烯苯组成的螯合基团 能螯合石蜡包埋 组织在高温裂解后释放的内源性二价金属离子如、等 从而阻止其在 高温下断裂的作用并通过结合金属离子 防止降解 取法则是利用细胞裂解液裂解细胞 从细胞中游离出来的分子被吸附到磁 性颗粒表面 蛋白质等分子不被吸附而留在溶液中。在磁场作用下 磁性颗粒 与液体分开 回收颗粒 再用液洗脱吸附的【圳。有报道 提取法不能去除溶液中的杂质和降解的碎片从而残留了抑制 影响了和分型结果。而磁珠提取法与一相比能有效去除以下的小片段和样品中的色素、蛋白质等杂质 且磁珠法不需要离心 在硕士学位论文 同一个反应管内提取 没有样品损失。但已有文献证实 磁珠提取法也会产 生样品损失 其原因可能为提取过程中反复的振荡将片段振碎为更小的 片段 反复的吸除反应管内液体 也造成了样品损失。 提取同样在一 个反应管中进行 避免了提取过程中反复振荡及吸除管内液体所造成的样品损 这种提取方法除了具有前面提到的优势外结合。纯化试剂盒 使用 不但有效的去除了溶液中残存的色素、蛋白质及盐离子 还可以去 除因甲醛介导的损伤所产生的大量碎片 从而起到高效回收、纯化模板 的作用‘。这一结论在本次实验研究中也得到了印证 从提取扩增后 的含量以及分型的成功率两方面看 一提取结合 纯化试剂盒纯化的结果都好于另外两种方法。此外 本次研究还讨论了三种脱 蜡方法和提取方法的交互相应 结果显示脱蜡方法与提取方法间的交互效应并 无统计学意义。 综上所述 二甲苯脱蜡 提取再经过。纯化试 剂盒纯化 从石蜡包埋组织提取以及检测效果较好。水浴和微波两 种加热脱蜡的方法的效果尚不能取代传统的二甲苯脱蜡。磁珠提取及纯化的 分型成功率与。纯化试剂盒的分型成功率之间的差异虽然没 有统计学意义 但从提取液中的含量以及操作简易程度上比较 较好的石 蜡包埋组织提取方法仍然是使用一提取结合纯化 试剂盒纯化法。第一章福尔马林固定石蜡包埋组织中种提取方法的比较研究 试剂盒磁珠提取硕士学位论文 结合试剂盒 结合第一章福尔马林固定石蜡包埋组织中种提取方法的比较研究

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